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在用紫外可見分光光度計(jì)儀器做定量分析時(shí)，通常液層厚度是相同的，按照比爾定律，濃度與吸光度之間的關(guān)系應(yīng)該是一條通過直角坐標(biāo)原點(diǎn)的直線。但在實(shí)際工作中，往往會(huì)偏離線性而發(fā)生彎曲，若在彎曲部分進(jìn)行定量，將產(chǎn)生較大的測定誤差。導(dǎo)致偏離線性的主要原因有化學(xué)因素和光學(xué)因素兩方面。

1. 化學(xué)因素

 比爾定律只有在描述稀溶液對單色光的吸收時(shí)才是成功的。在較高濃度（通常大于0.01mol/L)時(shí)將引起偏差。一方面是由于濃度較大時(shí)，溶液中的吸光粒子距離減少，以致每個(gè)粒子都可影響其臨近粒子的電荷分布。這種相互作用使他們吸收給定波長輻射的能力即吸光系數(shù)發(fā)生改變，從而使吸光度和濃度間的線性關(guān)系發(fā)生偏離。另一方面，濃度較大時(shí)，由于溶液對光折射率的顯著改變而使觀測到的吸光度發(fā)生較顯著的變化，從而導(dǎo)致對比爾定律的偏離。因此測定時(shí)宜在較稀的溶液（一般小于0.01mol/L）中進(jìn)行。

此外，吸光物質(zhì)可因濃度或其他因素改變而有離解、締合或溶劑的相互作用，而發(fā)生明顯偏離比爾定律的現(xiàn)象。為了避免這類誤差，應(yīng)嚴(yán)格控制溶液條件，使被測物保持在吸光系數(shù)相同的形式，以獲得較好的分析結(jié)果。

2.光學(xué)因素

非單色光的影響   比爾定律只適用于單色光，但一般的分光器所提供的入射光并不是純的單色光，而是波長范圍較窄的復(fù)色光。由于同一物質(zhì)對不同波長光的吸收程度不同，因而導(dǎo)致對比爾定律的偏離。

為了避免非單色光造成的誤差，測定時(shí)應(yīng)選用較純的單色光（即波長范圍盡可能窄的復(fù)合光）。隨著儀器制造工藝的提高和保養(yǎng)方法的改善，雜散光的影響可減少到忽略不計(jì)。

其他光學(xué)因素的影響  首先，光通過吸收池時(shí)，約有1/10或更多的光能因反射而損失。在一般情況下，可用參比溶液對比來補(bǔ)償。即先讓入射光通過參比溶液（除不含被測組分外其他成分與被測液相同）的吸收池，調(diào)節(jié)儀器的透光率為100%，然后再用于測被測液的透光率或吸光度。其次，溶液中的質(zhì)點(diǎn)對入射光的散射作用，可使透過光減弱。對于真溶液，由于質(zhì)點(diǎn)小，散射作用不強(qiáng)，同時(shí)因有空白對比，一般不影響吸光度測量。單溶液如含膠體、蛋白質(zhì)等大的質(zhì)點(diǎn)，則散射作用增強(qiáng)，而且不易制備參比液加以補(bǔ)償，因而常使測得的吸光度偏高，故應(yīng)盡量避免。   另外，在實(shí)際測定中，由于儀器性能限制，通過吸收池的光不是真正的平行光，而是稍有傾斜的光束，這將使通過吸收池的實(shí)際光程L增加而影響A的測量值。這是同一物質(zhì)溶液用不同儀器測定吸光度值產(chǎn)生差異的原因之一。